干貨 | 原來色譜柱長度對分離度影響這么大？實踐告訴你不知道的秘密

色譜柱使用過程中你是否有遇到分離度的問題：

減小粒徑，擔心柱壓太高？

增加柱長，擔心分離度增加幅度太小？

來來，小編來教你一招

試試縮短柱長吧

既能提高分離度，還能降低成本

一、有趣的實驗現象，有圖有真相

       以三七含量測定為例，色譜柱柱長從250mm縮短為150mm，一起來看看譜圖變化吧。

（1）Athena C18-WP  4.6 × 250mm, 5μm

（LAEQ-462572，三七含量測定）

（2）Athena C18-WP  4.6 × 150mm, 5μm

（LAEQ-461572，三七含量測定）

       綜上，三七含量測定時，色譜柱柱長從250mm縮短為150mm，人參皂苷Rg1和相鄰雜質峰的分離度從1.41增大到了1.74。

二、透過現象看本質，不違背基本規律

       通常較長的色譜柱，柱效更高，分離效果更好，而上述的實驗現象是相反的，它是怎么發生的呢？我們來分析一下：

       流動相的梯度程序如下：

       從出峰時間，我們可以估算Rg1出峰時流動相的組成（流動相中乙腈的比例）：

       我們可以看出，和Athena C18-WP  4.6 × 250mm, 5μm相比，采用Athena C18-WP  4.6 × 150mm, 5μm，人參皂苷Rg1出峰時乙腈的比例更低，我們知道，反相色譜分離模式，降低流動相中有機相的比例，有利于提高分離度，而此時由于長度縮短、柱效降低引起的分離度下降起到次要作用，綜合結果，分離度得到改善。

三、現實條件不滿足，怎么辦？

       如果我們手頭沒有150mm的色譜柱，實驗又比較著急，我們還可以嘗試提高流速的方法，下邊還是以三七含量測定為例子，采用Athena C18-WP  4.6 × 250mm, 5μm，流速從1.0ml/min提高到1.2ml/min，人參皂苷Rg1出峰時間提前，出峰時乙腈的比例更低，人參皂苷Rg1和相鄰雜質的分離度從1.41提高到1.52。

        溫馨提示：此例子僅是為了提供一個思路，雖然通過改變流速，Rg1和相鄰雜質峰分離改善，但同時引起Rb1受到雜質峰的干擾，此案例該方法不可行。

四、總結

       梯度洗脫時，遇到分離度問題，可以嘗試縮短柱長或者提高流速的方法，此時是出峰時有機相比例降低造成的分離度提高和柱效降低引起的分離度下降的一個較量。如果前者起主要作用，分離度可以得到改善，如果后者起到主要作用，會導致分離度下降。

五、彩蛋時刻

       三七含量測定過程，經常會遇到分離度、基線漂移等問題，各個廠家也紛紛推出柱，采用安譜Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571），即可輕松實現柱的效果。

1. 良好的分離性能

       采用安譜實驗Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色譜柱，按照2015版《中國藥典》條件，做三七含量測定，三七皂苷R1的柱效遠大于4000，人參皂苷Rg1和相鄰雜質峰分離度達到2.1。

2. wan美的批次重現性

       采用3個不同批次的Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色譜柱，做三七含量測定，三七皂苷R1的柱效都遠大于4000，三七皂苷R1的出峰時間以及人參皂苷Rg1和相鄰雜質峰的分離度都能得到很好的重現。

3. 優異的穩定性

       采用Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色譜柱，做三七含量測定，連續進供試品溶液100針，三七皂苷R1的柱效、人參皂苷Rg1和相鄰雜質峰的分離度保持穩定，Athena C18 4.6 × 150mm, 5μm（LAEQ-461571）色譜柱具有優異的穩定性。